競(jìng)爭(zhēng)ELISA

此法主要用于測(cè)定小分子抗原及半抗原，其原理類似于放射免疫測(cè)定。其基本程序?yàn)椋?span>

① 抗體包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

② 加入待檢抗原及一定量的酶標(biāo)抗原（對(duì)照孔僅加酶標(biāo)抗原）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

③ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液

④ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。

被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量由酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來(lái)確定，如果待檢溶液中抗原越多，被結(jié)合的標(biāo)記抗原的量就越少，有色產(chǎn)物就減少，這樣根據(jù)有色產(chǎn)物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測(cè)；其主要不足在于每種抗原都要進(jìn)行酶標(biāo)記，而且因?yàn)榭乖慕Y(jié)構(gòu)不同，還需應(yīng)用不同的結(jié)合方法。此外，試驗(yàn)中應(yīng)用酶標(biāo)抗原的量較多。

阻斷ELISA

本法主要用于檢測(cè)型特異性抗體。該方法現(xiàn)已成為豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬偽狂犬病（PR）及豬胸膜肺炎（AP）的主要檢測(cè)方法。下面以AP2型抗體的阻斷ELISA檢測(cè)法為例介紹其操作程序：

① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

② 用200μl阻斷緩沖液進(jìn)行封閉 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

③ 加工作量1:4稀釋被檢豬血清100μl → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干

⑤ 加100μl工作量豬抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液

⑦ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。

本試驗(yàn)同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清對(duì)照、兔抗AP2型陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照。

抗體捕捉ELISA

本法主要用于檢測(cè)IgM抗體。由于IgM抗體出現(xiàn)于感染早期，所以檢測(cè)出IgM，則可作為某種疾病的早期診斷。抗體捕捉ELISA根據(jù)所用標(biāo)記方式不同可分為標(biāo)記抗原、標(biāo)記抗體、標(biāo)記抗抗體捕捉ELISA等幾種，其中以標(biāo)記抗原捕捉ELISA比較有代表性，該方法的主要程序?yàn)椋?span>

① 用抗u鏈（抗IgM重鏈）抗體包被→37℃ 60分鐘后置4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

② 加待檢血清 → 37℃ 2小時(shí)，洗滌三次、拋干

③ 加酶標(biāo)抗原 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

④ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液

⑤ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。

斑點(diǎn)ELISA

與常規(guī)的微量板ELISA比較，Dot-ELISA具有簡(jiǎn)便、節(jié)省抗原等優(yōu)點(diǎn)，而且結(jié)果可長(zhǎng)期保存；但其也有不足，主要是在結(jié)果判定上比較主觀，特異性不夠高等。該方法的主要操作程序?yàn)椋?span>

⑴載體膜的預(yù)處理及抗原包被　取硝酸纖維素膜用蒸餾水浸泡后，稍加干燥進(jìn)行壓圈。將陰性、陽(yáng)性抗原及被檢測(cè)抗原適度稀釋后加入圈中，置37℃使硝酸纖維素膜徹底干燥。每張7cm×2.3cm的膜一般可點(diǎn)加40－53個(gè)樣品，每個(gè)壓圈可加抗原液1－20μl。

⑵ 封閉　將硝酸纖維素膜置于封閉液中，37℃感作15－30分鐘。封閉液多采用含有正常動(dòng)物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。

⑶ 加被檢血清　可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量適度稀釋的待檢血清，37℃反應(yīng)一定時(shí)間，用洗滌液洗三次，每次1－3分鐘。洗滌液一般為一定濃度的PBS-Tween溶液。

⑷ 加酶標(biāo)抗體，37℃反應(yīng)一定時(shí)間后，用洗滌液洗三次。

⑸顯色　加入新鮮配制的底物液，37℃反應(yīng)一定時(shí)間后，去掉底物液，加蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。

⑹ 結(jié)果判定　以陽(yáng)性、陰險(xiǎn)血清作為對(duì)照，膜片中央出現(xiàn)深棕紅色斑點(diǎn)者為陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。

布ELISA

（C－ELISA） C－ELISA（Cloth-ELISA）是加拿大學(xué)者Blais,B. W.等于1989年建立的一種新型免疫檢測(cè)技術(shù)。該方法是以疏水性聚脂布（Hydrophobic Polyester Cloth）即滌綸布為固相載體，這種大孔徑的的疏水布具有吸附樣品量大，可為免疫反應(yīng)提供較大的表面積，提高反應(yīng)的敏感性，且容易洗滌，不需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)。其基本原理與Dot-ELISA類似，只是載體不同。以對(duì)布氏桿菌抗原的檢測(cè)為例，C－ELISA的主要程序?yàn)椋?span>

⑴ 首先把抗布氏桿菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，并經(jīng)洗滌及封閉；

⑵ 加被檢樣品并于室溫下感作30分鐘，然后洗5次；

⑶ 加酶標(biāo)記的抗布氏桿菌抗體，于室溫下感作30分鐘，然后洗滌5次；

⑷ 加入底物液顯色；

⑸ 測(cè)定OD值。